پایان نامه طبقه بندی ژنوتیپ‌ها از لحاظ ژنهای آنتی‌پورتر
چکیده
به منظور بررسی مکانیزمهای مقاومت به شوری در مرحله جوانهزنی در ارقام گندم برای استفاده در برنامههای دورگگیری و اصلاح نباتات، 6 رقم از مناطق کویری و شمال ایران بنامهای (کویر، ارگ، بم، آرتا،مروارید و دریا) انتخاب و در پنج سطح شوری شامل (0، 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 میلیمولار) کشت گردید. در هر روز تعداد بذور جوانه زده و نیز پس از 12 روز طول کلئوپتیل اندازهگیری شد. شاخصهای جوانهزنی از طریق فرمول المدرس() محاسبه و نهایتاً ارقام حساس و مقاوم شناسایی شد. در ادامه، در 5 رقم میزان بیان نسبی ژنهای آنتی پورتراز طریق روش کمی بیان نسبی ژن (Real Time PCR) ارزیابی شد. نتایج نشان داد که بیان نسبی ژنهای مربوط به آنتی پورترهای TaNHX1 و TaNHX2 در ارقام مقاوم و ارقام حساس تفاوت معنی دار داشت، بطوریکه با افزایش سطح شوری (استرس) آنتی پورتر TaNHX2 در ارقام مقاوم بیشتر بیان شده بود. بنابراین در ارقام مقاوم مورد مطالعه بیان نسبی TaNHX2 نسبت به TaNHX1 در مکانیزم مقاومت نقش بیشتری داشته است. ارقام حساس با وجود افزایش بیان ژنهای TaNHX1 و TaNHX2 در سطوح پایین شوری ولی میزان بیان آنها کمتر از ارقام مقاوم بوده و کارایی زیادی در ایجاد مقاومت نداشته است. بیان نسبی ژنهای TaNHX1 و TaNHX2 و رابطه آن با شاخصهای جوانهزنی در دو رقم تفاوت داشت که این نتیجه در اثر وجود اثر متقابل ژنوتیپ × سطوح شوری حاصل شده است. بررسی بیان نسبی ژن TaNHX2 میتواند در ارقام مقاوم در سطح شوری نسبتاً بالای 3/0 میلیمولار بعنوان ماکر استفاده شود.
کلمات کلیدی: ژنهای آنتی‌پورترNa+/H+، شوری، گندم
مقدمه
با توجه به اینکه جمعیت دنیا به طور فزاینده‌ای روبه افزایش است و دانشمندان پیشبینی کردهاند که در سال 2030 میلادی جمعیت کره زمین به 10 میلیارد نفر می‌رسد، اکنون این سوال پیش می‌آید که برای تهیه و تأمین مواد غذایی برای چنین جمعیتی چه باید کرد و چه چاره‌هایی اندیشید (رنجبر، 1392). غلات مهم‌ترین گیاهان زراعی هستند (امام، 1383)، تولید کل غلات جهان 8/1 میلیارد تن است که بیشترین میزان آن (حدود 500 تا 600 میلیون تن) به گندم اختصاص دارد و از نظر سطح زیر کشت و تولید سالیانه نیز گندم در درجه اول اهمیت قرار دارد (صفی خانی، 1386).
گندم گیاهی است که در سراسر دنیا از کرانههای قطبی تا حوالی استوا کشت می‌شود (نجفی‌میرک و شیخی‌گرجانی، 1384). کشت و همچنین رشد و نمو این نبات در بسیاری از نقاط دنیا و در شرایط آب و هوایی مختلف امکان‌پذیر میباشد (شیخ زاده مصدق، 1392). گندم اولین و مهم‌ترین گیاه زراعی تأمین کننده نیاز‌های غذایی بشر است که حدود صد قرن پیش اهلی شده است. با توجه به رشد روز افزون جمعیت جهان اهمیت غذایی و اقتصادی گندم روز به روز بیشتر می‌گردد (خدابنده، 1376). بنابراین ضرورت افزایش تولیدات غذایی، جهت تامین نیاز‌های جمعیت روز افزون اجتناب ناپذیر میباشد (رنجبر، 1392). مهم‌ترین مصرف گندم در جهان برای تغذیه انسان است و همچنین در پرورش دام و طیور، کاغذ سازی و بسیاری از صنایع دیگر مورد استفاده قرار می‌گیرد (خدابنده، 1376).
تنش در موجودات زنده به معنی انحراف از شرایط مطلوب برای زندگی تعریف می‌شود. هر عامل محیطی که باعث ایجاد صدمه یا خسارت در موجود زنده شود، تنش بیولوژیک نام دارد. تنش از نظر علم بیولوژی به نیروهایی گفته می‌شود که از طریق تأثیر بر واکنش‌های طبیعی گیاه، باعث کاهش نمو، رشد و تولید و کاهش عملکرد گردد (فیشر، 1989).
تنش شوری یکی از تنش‌های غیرزنده است که بشر از هزاران سال پیش تاکنون با آن دست به گریبان بوده است. شور شدن اراضی از زمانی آغاز گردید که انسآن‌ها شروع به عملیات کشاورزی کردند و توسعة سریع و نامناسب سیستم‌های آبیاری در مقیاس بزرگ منجر به گسترش پدیدة شوری در اراضی قابل کشت گردید (خوش‌خلق‌سیما و عسگری، 1380).
هیچ قاره و اقلیمی عاری از خاک‌های متاثر از شوری با منشاء اولیه یا ثانویه نیست. این خاک‌ها حدوداً یک میلیارد هکتار از سطح زمین را پوشانیده‌اند که 75 میلیون هکتار از آن در جنوب غربی آسیا قرار دارد. ایران با 27 میلیون هکتار اراضی شور در مقام اول کشورهای این ناحیه قرار دارد و پس از آن هند و پاکستان به ترتیب با 8/23 و 5/10 میلیون هکتار مقام دوم و سوم را دارند (صادقی و همکاران، 1385).
در میان اندام‌ها و مراحل مختلف رشد گیاه شوری بیشترین اثر را روی جوانهزنی بذر و ریشه‌های کم عمق دارد. زیرا نمک عمدتاً در لایه‌های بالای خاک تجمع می‌کند (سومانی، 1991). جوانه‌زدن پدیده بسیار پیچیده‌ای است که طی آن تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بسیاری در بذر انجام می‌گیرد تا جنین فعال گردد. شوری ابتدا جذب آب را کاهش می‌دهد؛ زیرا سبب کاهش پتانسیل اسمزی آب خاک می‌گردد، از طرف دیگر سبب سمیت یعنی تغییر فعالیت آنزیمی، اختلال در متابولیسم پروتئین‌ها، بهم ریختن تعادل هورمونی و کاهش استفاده از ذخیره بذر می‌شود (به نقل از میرزا معصوم زاده، 1392).
وجود تنوع ژنتیکی برای موفقیت در اصلاح نباتات ضروری است. به طوری که انتخاب موفقیت آمیز ژنوتیپ‌های برتر از داخل توده‌های مورد اصلاح بستگی به وجود تنوع ژنتیکی دارد و بدون آن هیچ پیشرفتی در اصلاح امکان‌پذیر نیست (خالدی، 1373 به نقل از مطلوبی اقدم، 1387). برای استفاده از سرمایه عظیم تنوع ژنتیکی اطلاع از ماهیت و میزان تنوع در ژرم پلاسم از اهمیت زیادی در برنامههای اصلاحی برخوردار است زیرا والدینی که از لحاظ ژنتیکی متفاوت هستند هیبرید با هتروزیس بیشتر تولید می‌کنند و احتمال بدست آوردن نتاج تفرق یافته برتر از والدین را افزایش می‌دهند (باقری و همکاران، 1375).
برای استفاده از زمین‌های شور در کشاورزی سه امکان وجود دارد:
1- تغییر محیط: مشخص است که جبران کمبود یک عنصر در خاک به مراتب آسان‌تر از رفع مازاد یک عامل میباشد روش‌های مختلفی برای رفع شوری خاک وجود دارد ولی همگی آنها پرهزینه هستند.
2- تغییر گیاهان مورد کشت یا تعویض گیاهان زراعی حساس به شوری با گونه‌های سازگار به شوری یا هالوفیت‌ها.
3- اصلاح گیاهان زراعی جهت افزایش تحمل شوری از طریق منابع ژنتیک موجود کار با استفاده از روش‌های کلاسیک اصلاح‌نباتات و روش‌های نوین مهندسی ژنتیک (یئو، 1989 و خوش‌خلق‌سیما و عسکری، 1380).
طی دهه‌های گذشته تلاش‌های فزاینده‌ای برای بدست آوردن ژنوتیپ‌های متحمل به شوری که قادر به رشد در محیط‌های شور باشند، صورت گرفته است. با این حال ژنوتیپ‌های زراعی اصلاح شده برای تحمل شوری وجود دارد که به عنوان یک راه حل اقتصادی در اکوسیستم‌های شوری مورد بهره برداری قرار گرفته‌اند (کولیس، 1993).
از آنجایی که فنوتیپ گیاه از اثر توام ژنوتیپ و محیط شکل می‌گیرد، اثر شوری توام با اثر سایر عوامل محیطی در یک گیاه جلوه‌گر می‌شود از این رو بررسی وراثت‌پذیری تحمل شوری در گیاهان مشکل است (شاتون، 1984).
بررسی مکانیزمهای مولکولی مقاومت به شوری در ارقام متفاوت، این امکان را می‌دهد که شناخت کاملی از زمینه ژنتیکی ارقام بدست آورده و از آنها به‌صورت آگاهانه در تولید ارقام مقاوم استفاده کرد. منابع مقاومت به شوری توسط TFها، ژنهای Nax1 وNax2، ترانسپورترها، منابع آنتی‌اکسیدان‌ها (ضعیفی‌زاده و همکاران، 2012) گزارش شده‌اند. شناخت ارقام و ژنوتیپ‌های اصلاح شده ایرانی از لحاظ پتانسیل‌های منابع مقاومت به شوری از جنبه‌های ملکولی مخصوصاً ترانسپورترهای H+/Na+ما را در اصلاح و استفاده از آنها دربرنامه‌های تلاقی و دورگگیری های موفق یاری نماید.
1-2- پیشینه پژوهش
تنش شوری یکی از مشکلات عمده کشاورزی به ویژه در مناطق خشک و نیمه خشک میباشد. اثرات منفی ناشی از این تنش مانع رسیدن گیاهان به حداکثر پتانسیل عملکرد می‌گردد (پاردیا و داس، 2005). اثرات منفی عمده ناشی از شوری در گیاهان به دلیل افزایش غلظت یون‌های سمی در گیاه و ایجاد عدم تعادل یونی همراه با تنش کم آبی در گیاه است (بلوموالد و آپسه، 2000). سدیم یکی از یون‌هائی است که با افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم گیاهان تحت تنش شوری موجب اختلال در فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاه می‌شود (تستر و دونپورت، 2003). در حقیقت افزایش یون سدیم اختلال در جذب و عمل یون پتاسیم و نتیجتاً سبب افزایش نسبت Na+/K+ می‌شود که‌این موضوع اکثراً فرآیندهای فیزیولوژیک گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهد (خان و عبدالله، 2003). بنابراین جهت تحمل تنش شوری ضروری است که گیاه بتواند غلظت یون سدیم را در سیتوپلاسم پایین نگه دارد.
در گیاهان، یون سدیم به واسطه فعالیت آنتی‌پورترهای Na+/K+از سیتوزول به بیرون رانده می‌شود. آنتی‌پورترهای واکوئلی با فرستادن یون‌های سدیم به درون واکوئلی گیاه آن را از سیتوزول دور می‌کنند. تحت شرایط تنش شوری، بیان ژن رمز کننده آنتی‌پورترهای واکوئلی افزایش می‌یابد که نشان از اهمیت این پروتئین در مکانیزمهای تحمل تنش دارد (فوکودا و همکاران، 1996). با تحقیقات انجام شده در گیاهان مشخص گردیده که آنتی‌پورترهای واکوئلی توسط یک خانواده چندژنی رمز می‌شوند برای مثال در ذرت و آرابیدوپسیس شش ایزوفرم برای این ژن وجود دارد (زورب و همکاران، 2005).
همانگونه که ذکر گردید گزارش‌های متعددی دال بر اهمیت آنتی‌پورترهای واکوئلی در تحمل تنش شوری وجود دارد که در این میان ژنهای رمز کننده‌این پروتئین در گیاهآن‌هالوفیت جایگاه ویژه‌ای دارند (پاردیا و داس، 2005؛ یوکویی و همکاران، 2002 و زانگ و همکاران، 2005). هالوفیت‌ها با پایین نگه داشتن غلظت یون‌های سمی از جمله سدیم در سیتوزول تحت شرایط تنش این امکان را برای خود فراهم می‌آورند که بتوانند تنش را به خوبی پشت سر بگذارند (پاردیا و داس، 2005). بنابراین ژنهای رمز کننده آنتی‌پورترهای واکوئلی در گیاهآن‌هالوفیت می‌توانند نامزدهای مناسبی برای اصلاح گیاهان زراعی مهم و حساس نسبت به تنش شوری باشند. با استفاده از این ژن‌ها از طریق مهندسی ژنتیک می‌توان گیاهان زراعی متحمل نسبت به تنش شوری ایجاد نمود، علاوه بر این می‌توان با بررسی و تجزیه و تحلیل توالی نوکلئوتیدی این ژن‌ها و توالی اسیدآمینه‌ای پروتئین‌های رمزشونده توسط آنها و مقایسه آنها با گیاهان معمولی به درک بیشتری نسبت به توانایی های این آنتی‌پورترها در مکانیسم تحمل دست یافت.
گیاهان قادرند تنش را دریافت کرده و سیگنال تنش را به درون سلول خود انتقال داده و مکانیزمهای سازگاری خود را فعال کنند. مکانیسم سازگاری گیاهان به تنش های محیطی غالبا با تغییر بیان ژن‌هایشان همراه است. یکی از راه‌های بررسی الگوی بیان ژن‌ها اندازهگیری میزان رونوشت‌های mRNAکدشده از تک ژن به کمک روش‌هایی مانند ریزآرایه ، SAGE,cDNAو AFLP است. برای مثال با استفاده از cDNAتعداد 194 رونوشت mRNAشناسایی شدند که بیان شان تحت تنش شوری در آرابیدوپسیس پنج برابر افزایش یافت شده بود (موتواکی و همکاران، 2002). در تحقیق مشابه الگوی بیان ژنهای برنج تحت تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که بیش از 10% ژن‌ها در فاز اولیه تنش شوری کاهش یا افزایش بیان نشان می‌دهند (کاوازاکی و همکاران، 2001). با وجود قدرت بالای روش‌های ذکر شده در تجزیه بیان ژن‌ها، هیچ یک از این روش‌ها اطلاعات کمی و کیفی از فرآورده نهایی ژن‌ها (پروتئین‌ها) در اختیار قرار نمی‌دهند.
ماژول و همکاران (2000) در بررسی اثر تنش شوری بر روی ریشه‌های دو رقم گندم مقاوم و حساس، 9 پروتئین پاسخ دهنده را شناسایی کردند. داداشی دوکی و همکاران (2006) به بررسی الگوی بیان پروتئین در پانیکول برنج تحت تنش شوری پرداختند، در این تحقیق ژنوتیپ IR651به عنوان مقاوم به شوری انتخاب شده و 12 روز پس از اعمال تنش شوری نمونهگیری از پانیکول‌های جوان برنج انجام گرفته است. نمونه‌های پانیکول در سه سطح از لحاظ اندازه تقسیم‌بندی شدند. الگوی بیان این سه گروه تجزیه شده و بیان 13 پروتئین در هر سه گروه دچار تغییر بیان قابل ملاحظه‌ای شده بودند با شناسایی این پروتئین‌ها بوسیله طیف سنجی جرمی، به عنوان آنتی‌اکسیدان‌ها و پروتئین‌های درگیر در ترجمه، رونویسی، انتقال و سنتز ATPتشخیص داده شدند. از آنجائیکه شناسایی منابع مولکولی مقاومت یا تحمل به شوری می-تواند ما را برای استفاده از آنها در برنامههای دورگگیری هدایت نماید لذا اهداف این تحقیق به شرح زیر میباشد.
1-3- اهداف تحقیق
1- مقایسه و بیان ژنهای آنتی‌پورتر ارقام حساس و مقاوم از لحاظ بیان این ژن‌ها.
2- طبقه بندی ژنوتیپ‌ها از لحاظ ژنهای آنتی‌پورتر
3- بررسی میزان مقاومت به شوری در ژنوتیپ‌های مورد مقایسهدر مرحله جوانهزنی
4- بررس رابطه بین میزان بیان ژنهای آنتی پورترو میزان مقاومت به شوری در مرحله جوانهزنی
- Biological Stress
- Microarray