پایان نامه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء کنندگان 3 استان کرمان، یزد و اصفهان
قسمتی از متن:
PCR Nested :
در روش PCR Nested از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود به طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای می‌گیرد در این روش، ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف، در طول 15-30 چرخه تکثیر می‌شود که احتمال دارد به میزان دلخواه اختصاصی نباشد. سپس محصول PCR حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحلة دوم PCR انجام شده و ترادف کوچکتری از DNA که درون محصولPCR رولی است به اندازة 15-40 چرخة تکثیر می‌شود که خصوصیت آن، تکثیر قسمت داخلی تر یا به عبارت دیگر اختصاصی تر می‌باشد. مزایای این روش تغییر یافتة PCR عبارت است از :
1) نیاز به پروپ (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است.
2) حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است.
3) به دلیل انتقال محصول PCR دور اول به لولة جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود (یعنی 1386)
ژل الکتروفروز :
یکی از روشهای متداول مشاهدة محصولات واکنش PCR (به طور کلی DNAی دو رشته‌ای رنگ آمیزی DNA با اتیدیون برومایه و بارگذاری (LOAD) درون چاهک بر روی ژل آکارز است. آگار مخلوطی از دو پلی ساکارید آگارز و آگاروپکتین است که از چند جلبک دریایی بدست می‌آید. خاصیت ژله‌ای آگار به طور عمده بدلیل وجود آگارز است و خصوصیات نامطلوب آن در حین (الکترواسموز و کد رشدگی) از آگاروپکتین ناشی می‌شود. انواع مختلفی از آگارز را شرکت‌های سازنده تولید می‌کنند که تفاوت آن‌ها در میزان خلوص آگارز از نظر عدم حضور پلی ساکاریدهای باردار(که موجب الکترواسموز می‌شوند) درجة ذوب، قوام و میزان شفافیت است با برقراری یک جریان الکتریکی و در حضور بافر عبور دهندة جریان، قطعات DNA که دارای بار منفی هستند، بر مبنای طول خود با سرعت‌های متفاوتی در ژل آگارز حرکت می‌کنند از قطب منفی به سمت قطب مثبت می‌روند و بنابراین به تفکیک طول از یکدیگر جدا می‌شوند در این حالت اگر یک رنگ آشکار ساز مانند اتیدیوم بروماید در بافر الکتروفروز یا ژل موجود باشد در لابه‌لای بازهای DNA ی دو رشته‌ای وارد می‌شود و با استفاده از پرتوهای (ultro violet) همچنین با استفاده از یک اندازه نمای SONA (DNA sizar marker) با پله‌هایی به طول متخصص (به عنوان راهنما برای بررسی نمونه‌های آشکار شده روی ژل) می‌توان DNA را بر روی ژل مشاهده کرد.
توجه به این نکته ضروری است که قدرت تفکیک ژل در یک محدودة مشخص نسبت مستقیم با غلظت ژل دارد. بنابراین برای آشکار سازی قطعات کوچک یا در مواردی که هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول کم در یک نمونه وجود دارد که احتیاج به تفکیک بیشتر است، از ژل غلیظتر و برای قطعات بزرگتر یا در مواردی که هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول بیشتر در یک نمونه وجود دارد که احتیاج به تفکیک خیلی بالا نیست، از ژلی با غلظت کمتر استفاده می‌شود.
تعیین توالی مولکول DNA (Soguncing)
امروزه تعیین توالی DNA در زمره اندیشمندترین ابزارهایی است که در زیست شناسی ملکولی برای شناسایی و تعیین محل دقیق نوکلئوتیدها در ساختمان ژن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.
نخستین بار فردریک سنگر (1974) روش تعیین توالی A را با استفاده از دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات‌ها و بر مبنای ساخت DNA معرفی نمود قرار گرفتن این نوکلئوتیدها که در محل 3 کلکول قند فاقد اکسیژن هستند در عین پلیمراسیون در طول زنجیره DNA موجب ختم سنتز رشته جدید می‌گردد و در صورتی که بین نوکلئوتیدهای رادیواکتیو نشاندار شده باشند می‌توان محل نوکلئوتیدها را در هر رشته متخصص نمود.
تقریباً به صورت همزمان روش دیگری برای تعیین توالی بوسیله الن ماگنتام والترگیلبرت ابداه شد که به روش شکسته شدن شیمیایی معروف است در این روش DNA در محل هر یک از نوکلئوتیدهای چهار گانه بوسیله مواد شیمیایی خاصی شکسته می‌شوند که پس از الکتروفروز محل نوکلئوتیدها در زنجیره DNA قابل خواندن خواهد بود.
با آغاز پروژه ژنوم انسان روشهای جدید و سریعتری برای تعیین توالی ماده ژنتیکی سلولها مورد نیاز بود. در نظر داشت ه باشید که محققان مجبور بودند 3 میلیون جفت باز سازنده ساختار ژنتیکی انسان را تعیین توالی کنند. با استفاده از روشهای متداول در حدود 10 سال زمان صرف میلیونها دلار برای این پروژه پیش بینی می‌شد در نتیجه محققین درصدد ابداع روش سریعتر برای تعیین توالی برآمدند. تعیین توالی اتوماتیک DNA بعنوان روش جایگزینی با سرعت و دقت بالا توسط دانشمندان بخش زیست شناسی ساختاری LBL ابداع شد که 100-50 برابر سریعتر از روشهای پیشین بود در تعیین توالی اتوماتیک نوکلئوتیدها بجای رادیواکتیو با رنگ‌های فلورسانت نشانه دار شده در حین اکترفروز قطعات بر روی ژل اکریل آمید به محلی می‌رسند که با اشعه لیزر برخورد کرده و پس از تهییج نور فلورسانت خاصی ایجاد می‌شود که بوسیله دستگاه آشکار ساز دریافت شده و به پیام الکتریکی تبدیل می‌شود این پیامها به کامپیوتر منتقل شده و تا پایان واکنش داده‌ها بصورت اتوماتیک و بوسیله نرم افزارهای ویژه پردازش شده پیکها شناسایی گردید و توالیها که بصورت فایل متنی درآمده‌اند در اختیار استفاده کنندگان قرار می‌گیرد بدست آوردن نتایج مطلوب و قابل اطمینان از تعیین توالی اتوماتیک تا حد زیادی منوط به تهیه DNA عاری از هر گونه آلودگی با غلظت مناسب می‌باشد. هر گونه آلودگی اعم از نمک، پروتئین، کربوهیدرات، پرایمرها، یا مقدار زیاد DNTP به داده‌های حاصل از تعیین توالی تاثیر می‌گذارد استفاده از کمیت‌های تجاری تهیه و تخلیص DNA که معمولاً سریع، خوب و قابل اطمینان است معمولاً برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیک پیشنهاد می‌شود.
کمیت‌های تخلیص DNA به دو روش اساسی بیوشیمیایی هستند. فیلتر سیلیکا که جدا سازی را بر حسب اندازه نمونه انجام داده و مرحله جداسازی DNA در آب صورت می‌گیرد و دیگر ستون‌های تعویض آنیونی که مرحله جداسازی DNA در حضور غلظت بالایی از نمک صورت می‌گیرد. تجربه نشان داده است که نمونه DNA تخلبص شده بافنل – کلروفرم در سیستم تعیین توالی اتوماتیک نتایج مطلوبی نمی‌دهند. استفاده از بافرهای استات پتانسیم برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیک ترجیح دارد. در صورت استفاده از ستون‌هایی که بافر جداسازی انها حاوی غلظت بالایی از نمک است می‌توانید یک مرحله اضافی رسوب دهی با الحات آمونیوم (57/757/0) اتانول مطلق 70% در دمای اتاق انجام دهید تا نمک‌های اضافی از نمونه شما حذف گردد مقدار اضافی کمک واکنش تعیین توالی را متوقف می‌نماید DNA جدا شده با بافر غلیظ نمکی از ستون و یا پس از رسوبدهی حداکثر نمک را طی شست و شو با اتانل 70% (حداقل 1 بار و حداکثر 4 بار) باید حذف نمود.
2-3-2 آزمون مولکولی
1-2-3-2 استخراج DNA
از کمیت استخراج اسید نوکلئیک با خلوص بالا (High pure nuckic acidkit) با بر حسب تجاری Roche و شماره کاتالوگ 11858874001 برای استخراج DNAی HBV استفاده شد. این کمیت برای خالص سازی اسید نوکلئیک ویروس ناز سرم، پلاسما یا خون کامل پستانداران طراحی شده است.
مزایای استفاده از این کمیت :
1- عدم استفاده از مواد سمی فنل یا کلروفرم
2- عدم نیاز به استفاده از اتانلی برای رسوب دادن اسید نوکلئیک
3- آسان بودن روش انجام استخراج در مقایسه با سایر روشهای استخراج
4- کاهش زمان انجام آزمایش در مقایسه با سایر روشهای استخراج
5- امکان استخراج RNA , DNA های ویروس موجود در نمونة مرد بررسی به طور همزمان