طرح توجیهی تولید صنایع غذایی بر پایه بیوتکنولوژی
چکیده
امروزه کمتر کسی در جوامع علمی وجود دارد که به اهمیت بیوتکنولوژی و تأثیر آن بر روی زمینه های مختلف آگاهی نداشته باشد. دانشی که محور پیشرفت و توسعه در بسیاری از کشورها گردیده است و سبب ایجاد تحولات عظیمی در بخشهای پزشکی، داروسازی، کشاورزی، صنعت و معدن و غیره شده است. بیوتکنولوژی در بخش کشاورزی که تأمین کننده نیاز غذایی بشر از هزاران سال پیش تاکنون بوده است تأثیر مهم عمیق داشته است تا آنچه واقعا بشر خواهان آن است را برای وی تأمین نماید. صنایع غذایی که آخرین حلقه زنجیره بخش کشاورزی می باشد. یکی از مستعدترین زمینه های حضور و فعالیت بیوتکنولوژی می باشد زیرا این صنعت برای بر آورده ساختن نیازهای غذایی سالم ، ارزان، بهداشتی و کافی برای جمعیت کنونی و آینده نیاز به روشهای جدید، سریع و کاربردی تر دارد که می تواند آنها را در دنیای بیوتکنولوژی بیابددر این طرح سعی گردیده است نقش هایی از بیوتکنولوژی در صنایع غذایی که شامل نقش مهندسی ژنتیک وDNA ی نو ترکیب در صنایع غذایی، جنبه های مختلف استفاده از میکروارگانیسم ها برای تولید مواد غذایی از قبیل اسیدهای آمینه، افزودنیهای غذایی، طعم دهنده ها، ویتامین ها، پروتئین میکروبی و غیره، تأثیر بیوتکنولوژی بر روی کیفیت غذایی، روشهای تشخیص سریع میکروبهای بیماریزای غذایی، ایمنی غذایی و مدیریت مواد زائد و… به طور کلی اشاره گردیده و در نهایت به بررسی تولید نشاسته از ذرت به عنوان مهمترین پلی ساکارید مورد استفاده در صنایع غذایی پرداخته شده است .
مطالعات صورت گرفته نشان داده است که جمعیت جهان تا اواسط قرن حاضر، دو برابر خواهد شد و این در حالی است که اکنون نیمی از کودکان جهان از غذای کافی محروم هستند. همچنین فشار از طرف مصرف کنندگان، خصوصاً در کشورهای صنعتی، باعث شده است که تولید محصولات غذایی بطرف استفاده از مواد افزودنی “طبیعی” و بکارگیری روش های فرآوری نزدیکتر به روش های طبیعی، جهت پیدا کند.، مواردی از این قبیل به همراه سایر مزایایی که وجود داشته اند، روش های بیوتکنولوژی در صنایع غذایی را گسترش داده اند. با توجه به گسترش صنایع غذایی در کشور ما، آشنایی مختصر با کاربردهای بیوتکنولوژی در صنایع غذایی مفید به نظر می رسد:
-۱ تعریف بیوتکنولوژی غذایی
-۲ تولید محصولات نهایی غذایی با استفاده از بیوتکنولوژی
-۳ تولید مواد افزودنی غذایی با استفاده از بیوتکنولوژی
-۴ اصلاح مستقیم مواد غذایی یا مواد افزودنی به غذا
-۵ تولید مواد کمک فراوری
-۶ کاربردهای تجزیه ای
-۷ تصفیه پسماند
************************************************************
تعریف بیوتکنولوژی غذایی در ارتباط با صنایع غذایی می توان بیوتکنولوژی را به صورت زیر تعریف کرد:
“استفاده از سلولهای زنده یا قسمتی از آنها، به منظور تولید یا اصلاح محصولات غذایی یا مواد افزودنی به غذا” از یک دیدگاه دیگر می توان کاربرد بیوتکنولوژی در صنایع غذایی را به دو بخش کاربرد بیوتکنولوژی سنتی و کاربرد بیوتکنولوژی مدرن تقسیم کرد:
درکاربرد “بیوتکنولوژی سنتی” در صنایع غذایی، از فناوری تخمیری (ریزساوارزه ها یا میکروارگانیزم ها) جهت تغییر مواد خام غذایی به محصولات غذایی تخمیری شامل پنیر، ماست، خمیر نان و غیره استفاده می گردد. استفاده از ریزسازواره ها و آنزیمها در این فرآیندها باعث ایجاد تغییرات در طعم، عطر و بافت مواد خام غذایی یا افزایش قابلیت نگهداری آنها می گردد. -۲ در بکارگیری “بیوتکنولوژی نوین” در صنایع غذایی، از ژنتیک مولکولی و آنزیم شناسی کاربردی بهمراه فناوری تخمیری، جهت بهبود خواص مواد افزودنی غذایی استفاده می گردد. در قسمت های بعدی این نوشتار، برخی از کاربردهای بیوتکنولوژی در صنایع غذایی به طور اجمال و در چند زمینه بیان می شوند…..
مقاله مقدمهای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش
مقدمه................................................................................................................
1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................
2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتری...............................................
3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت.....................
4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری...........
5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری................
6-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق الکتروپورش.....................................
7-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکرواینجکشن..............
8-1- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................
1-2- دست کاریهای جنسی.............................................................................
1-1-2- دست کاریهای جنسی با تکنیک ژینوژنز............................................
2-1-2- دست کاریهای مجموعه کروزومی به وسیله تکنیک اندروژنز..........
2-2- پلوئیدی...................................................................................................
1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................
2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................
مقدمه................................................................................................................
1-3- ایجاد کلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................
2-3- کلون کردن به وسیله ترکیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................
3-3- جابجایی هسته........................................................................................
4-3- جابجایی سلولهای سوماتیک جنینی به جنین دیگر.................................
5-3- دورگه گیری..........................................................................................
4- منابع............................................................................................................
بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان
مقدمه:
یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال 1980 گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی، موش، قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می کنند.
در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی که مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و کارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و کارایی بیان ژن وابسته به فاکتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفت به طوری که ضمن ساده کردن تکنک و کم کردن هزینه ها کارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تکنولوژی تکثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیک را ایجاد کرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بکارگیری اسپرم به عنوان یک ناقل مسئله جدیدی نیست بلکه در سال 1971 براکت (Brackett) با وارد کردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماکیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تکنیک را بر روی موش به کار گرفته است. در سال 1992 کهو (Khoo) تکنیک استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد کردن ژنهای جدید به ماهی زبر به کار گرفت. همچنین در سال 1993 ایکسی (Xie) و همکاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به کمک التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و کاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همکاران انتقال ژن به ماهی چنوک (Chinook) را با همین تکنیک شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستکاریهای ژنی در ماهیان با ذکر مثالهایی بررسی شده است.
1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان
جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یک لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی
4-3 – جابجایی سلولهای سوماتیک و جنینی به جنین دیگر
هو (Ho) و کان (Kane) در سال 1990 موفق به انتقال سلولهای نشانه گذاری شده طبیعی و جهش یافته ماهی زبرا به دیپلوئیدهای گیرنده شدند تا چگونگی اثر آنها را مطالعه نمایند. لین (Lin) و همکارانش به طور موفقیت آمیز 20 تا 100 سلول رنگ دانه ای یکسان ماهی زبرا را به سلولهای بلاستودرم البینو (فاقد رنگدانه ) گیرنده آن تزریق کردند 23 تا از مجموع 70 تا تالبینو که به آنها سلول رنگدانه ای منتقل شده بود پس از 4 تا 6 هفته شیمریک ( موجود دارای دو ویژگی متفاوت ) و 18 درصد از سلولها فقط رنگدانه داشتند. آزمایش مشابهی به وسیله نیلسون (Nilsson) و کلود (Cloud) در سال 1992 روی قزل آلای رنگین کمان انجام شد. بر طبق نتایج بدست آمده 1000 سلول نشانه گذاری را تزریق کردند که فلورسانس (نشانه) در 19 تا از 114 جنین شمریک یعنی به میزان 17 درصد دیده شده است. الگوی توزیع سلولها به طور گسترده ای در جنین شمریک پخش شده بود.
هروت ( Horvath ) و همکارانش سلولهای توتی پوتنت کپور دیپلوئید در مراحل مرولا یا بلاستولا را به یک جنین در مرحله 3 تا 4 سلولی منتقل نمودند تا با نمونه ها دیپلوئید طبیعی مقایسه نمایند. مشاهده شده که، میزان هاپلوئید برای این منظور مناسب تر است.
برای انجام این انتقال یک کارشناس می تواند در عرض یک ساعت تعداد زیادی از اینها را ایجاد نماید و موفقیت این تکنیک را می توان با یک کارکرژنتیکی ثابت کرد برای این منظور از مطالعه فلس استفاده شده سلولهای گیرنده هاپلوئید از یک ماهی ماده نقره ا بدون فلس (SSnn ) در نظر گرفته شد. در ضمن اینکه سلولهای دیپلوئید دهنده از زاده های ناشی از تلاقی یک نر فلس دار(SSnn ) و یک ماده فلس دار (Ssnn و SSnn) در نظر گرفته شده اگر بین زاده های ایجاد شد بچه ماهیان دارای فلس وجود داشته باشند این نشان می دهد که صفت از دیپلوئید دهنده منتقل شده است اگر چه این آزمایش موفق نبوده است ( تصویر 19).
تصویر 18- فرآیند جابجایی هسته در ماهی بالا: خارج کردن هسته از تخم ماهی (a) : جایگاه جسم قطبی و هسته (b) : ورود سوزن شیشه ای به سیتوپلاسم در جایگاه هسته (c): هسته به وسیله سوزن برداشته شده پایین : جابجایی هسته به تخم ماهی فاقد هسته (a): یک جنین بلاستولایی (b) جداسازی سلولهای بلاستولا در محیط فاقد کلسیم (c): یک هسته از سولولها با پیپت مکش می شود (d) : این هسته با میکرو پیپت به تخم فاقد هسته تزریق می شود.
تصویر 19- سیستم کلونینگ امکان پذیر با استفاده از سلولهای کپور معمولی در جنین مرولایی و بلاستولایی (1) ایجاد تخمک گذاری ژنوتیپ ماده ssnn (آئینه ای ) (2) لقاح (3): کورون زدایی با پروتئاز در مراحل اولیه جنینی (4): جدا کردن سلولهای جنین مرولایی بلاستولایی (5): افزایش سلولها در جنین میزبان 6- انکوباسیونو و مراقبت
مقاله بیوتکنولوژی کشاورزی راهی استراتژیک برای صرفه جوئی در نهاده های کشاورزی
بیوتکنولوژی به عنوان تکنیکهایی که در آن از ارگانیسمهای زنده برای ساخت یا ایجاد تغییرات در یک فرآورده استفاده می شود تعریف شده است، همچنین می توان مفاهیمی مانند افزایش محصول گیاهان و جانوران یا تولید میکروارگانیسمهایی برای کاربردهای ویژه را نیز به آن افزود. البته در این مقاله مفهوم مورد نظر تکنولوژی تغییر نقشه ژنتیکی است که تحت عنوان مهندسی ژنتیک در کشور ما و سایر نقاط جهان شناخته شده است می باشد.
بیوتکنولوژی از ظرفیت بالایی برای سودرسانی و اثرگذاری بر بخش کشاورزی، جنگل و پرورش آبزیان برخوردار است. تکنیهای مدرن بیوتکنولوژی دانشمندان را قادر می سازد که ژنهای جدا شده از ارگانیسمهای زنده را به ارگانیسمهای هدف منتقل سازند و در نتیجه سرعت و دقت بیشتری را نسبت به روشهای سنتی اصلاح بذر و نهال در اختیار بشریت قرار دهند. در مقایسه با بیوتکنولوژیهای سنتی اصلاح بذر، بیوتکنولوژی موجب افزایش پایدار بهره وری و فرآوری بهینه برای تقویت بهره برداری و تنوع محصول می گردد. بیوتکنولوژی امکان تکیه کمتر کشاورزان بر مواد شیمیایی را فراهم نموده و همچنین می تواند موجب حفظ منابع ژنتیکی و مدیریت بهینه منابع طبیعی شود.
بیوتکنولوژی همچنین باعث بروز چالشهای ویژه ای می شود. البته بروز این چالشها عمدتاً مربوط به زمان، مکان و چگونگی کاربرد تکنولوژی می شود. البته به کارگیری سریع بیوتکنولوژی و سرمایه گذاری در تحقیقات توسط بخش خصوصی در کشورهای صنعتی بیان گر این مطلب است که در آینده راه قابلیت رقابت و مزیت نسبی کالاهای کشاورزی در بازارهای بین المللی از طریق بیوتکنولوژی میگذرد. بنابراین بیوتکنولوژی با ظرفیت های بالایی که در اختیار کشورهای توسعه یافته قرار می دهد نقش عمده ای در توسعه کشاورزی ایفا نموده و نباید اجازه داد که توسعه و تولید ابزارهای مربوط به بیوتکنولوژی باعث ایجاد شکاف بیشتر بین کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه شود.
روبرو شدن با چالشهای پیش روی بخش کشاورزی در ایران مستلزم استفاده از تکنولوژیهای موجود می باشد. پیشرفتها در بیوتکنولوژی فرصتهای تازه ای برای حل و فصل مسائل مربوط به تولید غذا و امنیت غذایی و رقابت در بازارهای بین المللی و صرفه جویی در منابع ملی و طبیعی در اختیار ایران قرار می دهد. در حال حاضر بحثهای زیادی در اطراف بیوتکنولوژی در زمینه هایی مانند مسائل اخلاقی، حفاظت از محیط زیست، سلامت غذایی و حفاظت از حقوق مالکیت معنوی در حال انجام است این مسائل نیاز به بحث و بررسی در تمام سطوح جامعه دارند. جامعه علاقمند به دانستن این مطلب است که چرا در حالیکه روشهای سنتی اصلاح بذر برای دهه های متمادی قادر به تأمین غذای کافی بوده اند بایستی از روشهای مهندسی ژنتیک برای اصلاح بذر استفاده نمود. مردم همچنین علاقمند به دانستن این مطلبند که چه کسانی از بیوتکنولوژی سود می برند و در صورت بکارگیری مهندسی ژنتیک چه ریسکهایی وجود خواهد داشت و چه سازمانی مسئولیت مشکلاتی که در این زمینه بروز خواهد نمود به عهده خواهد گرفت (2002 (Khan and Shirani .
با توجه به مطالب بالا مقاله حاضر به بررسی الگوی گسترش استفاده از بیوتکنولوژی در کشورهای مختلف جهان می پردازد در کنار این مطلب ظرفیت بیوتکنولوژی در کمک به توسعه کشاورزی و صرفه جویی در نهاده های کشاورزی مورد بررسی قرار می گیرد. در انتها در مورد سیاستها در رابطه با موضوعات مرتبط با بیوتکنولوژی بحث و بررسی می شود، بخش نتیجه گیری به پیشنهاد سیاست های مناسب برای توسعه بیوتکنولوژی در ایران می پردازد.
اولین محصول با نقشه ژنی تغییر یافته که اجازه بهره برداری تجاری از آن صادر شد گوجه فرنگی Flaver – Saver نام داشت. نقشه ژنتیکی این نوع گوجه فرنگی به نحوی تغییر یافته بود که زمان رسیدن آن به تأخیر می افتاد و در نتیجه بو و طعم تازگی آن تا زمان رسیدن به ظرف غذا حفظ می شد. مجوز بهره برداری از این محصول در سال 1994 در ایالات متحده صادر شد این محصول یک موفقیت علمی بی نظیر ولی یک شکست تجاری کامل بود (2002 (Marra, et al, . در سال 2002 در سطح جهان 7/58 میلیون هکتار زیر کشت این محصولات بوده است، جدول 1 نشان دهنده روند افزایش سطح زیر کشت از سال 1996 تا سال 2002 می باشد.
جدول 1- سطح زیرکشت محصولات ترانسژنیک جهان از سال 1996 تا سال 2002 (میلیون هکتار)
سال | سطح زیر کشت (میلیون هکتار) |
1996 | 7/1 |
1997 | 0/11 |
1998 | 8/27 |
1999 | 9/39 |
2000 | 2/44 |
2001 | 6/52 |
2002 | 7/58 |
مجموع سطح زیر کشت از 1996 تا 2002 | 9/235 |
منبع: 2003 Clive James
البته بایستی بخاطر داشت که در افزایش سطح زیر کشت فقط منحصر به کشورهای توسعه یافته نبوده است بلکه کشورهای در حال توسعه نیز از سهم عمده ای برخوردار بوده اند (جدول 2).
جدول 2 – سطح زیر کشت محصولات با ژنهای تغییر یافته در سال 2000 و 2001 (کشورهای صنعتی و
در حال توسعه)
| 2000 | درصد | 2001 | درصد | تغییرات |
کشورهای صنعتی | 5/33 | 76 | 1/39 | 74 | 6/5 |
کشورهای در حال توسعه | 7/10 | 24 | 5/13 | 26 | 2/8 |
مجموع | 2/44 | 100 | 6/52 | 100 | 4/8 |
منبع: 2002 Clive James
همانطور که جدول 2 نیز نشان می دهد در سال 2000، 24 درصد سطح زیرکشت جهانی محصولات ترانسژنیک در کشورهای در حال توسعه قرار داشته که این مقدار در سال 2001 به 26 درصد رسیده است. در این بین ایالات متحده (در هر دو سال 2000 و 2001) به طور مطلق و نسبی بالاترین سطح زیر کشت را به خود اختصاص داده است. پس از ایالات متحده آرژانتین (کشور در حال توسعه) سطحی معادل 10 میلیون هکتار را در سال 2000 به کشت محصولات ترانسژنیک اختصاص داده که این مقدار در سال 2001 به 8/11 میلیون هکتار افزایش پیدا کرده است. سایر کشورهای در حال توسعه مانند چین سهم کمی را به خود اختصاص داده اند ولی در مورد چین یک مطلب جالب به نظر می رسد و آن اینکه اگر چه در مجموع فقط 5/1 میلیون هکتار از اراضی در سال 2001 تحت کشت محصولات ترانسژنیک قرار داشته است ولی بین سال 2000 و 2001 سطح زیر کشت محصولات ترانسژنیک در این کشور رشدی معادل 200 درصدی را نشان می دهد که در مقایسه با سایر کشورها رشد بسیار بالایی است.
جدول 3- سطح زیر کشت محصولات با ژنهای تغییر یافته در کشورهای مختلف در سالهای 2000 و 2001 (میلیون هکتار)
کشور | 2000 | درصد | 2001 | درصد | تغییرات | درصد |
ایالات متحده | 3/30 | 68 | 7/35 | 68 | 4/5 | 18 |
آرژانتین | 0/10 | 23 | 8/11 | 22 | 8/1 | 18 |
کانادا | 0/3 | 7 | 2/3 | 6 | 2/0 | 6 |
چین | 5/0 | 1 | 5/1 | 3 | 0/1 | 200 |
آفریقای جنوبی | 2/0 | 1 | 2/0 | 1 | 1/0 | 33 |
استرالیا | 2/0 | 1 | 2/0 | 1 | 1/0 | 37 |
مکزیک | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
بلغارستان | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
اروگوئه | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
رومانی | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
اسپانیا | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
اندونزی | -- |
| 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
آلمان | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |
فرانسه | 1/0 | 1 | 1/0 | 1 | 1/0 | -- |