مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac

مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L₇/L₁₂

3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L₇/L₁₂ و P39

5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیک

باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه

اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3

با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تک پلی مرآز Tag Polymerase تکثیر نمود. عوامل پایه ای ذکر شده شامل موارد ذیل است.

1- قالب

2- پرایمر جلو Forward

3- پرایمر عقب Revers

4- دروکسی نوکلئوتیدها LNTP

5- منیزیوم

6- بافر

7- آنزیم پلی مرآز

8- آب مقطر استریل

برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی کرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L₇/L₁₂ و P39 ابتدا مترادف نوکلئوتیدی ژنهای فوق را از مرکز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.

- کلونینگ ژنهای L₇/L₁₂ و P39 در کلونینگ pSK⁺:

برای کلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.

1- برش آنزیمی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.

1- برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یک ناحیه تکثیری ColE1، یک ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریک ناحیه f1 origin و یک ناحیه بنام multiple cloning site=MCS که جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تکثیز پلاسمید فوق از باکتری اشدیشیاکلی استفاده می گردد.

2- برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باکتری حاوی این پلاسمید را تکثیر میدهد. در ضمن تکثیر باکتری پلاسمید مورد نظر در باکتری همانندسازی کرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تکثیر باکتری از کشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیک آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت کشت مورد نظر کدورت مناسب را پیدا میکند. پس از آن پلاسمید از باکتری تخلیص میگردد.

خرید فایل