پایان نامه بررسی قابلیت ترکیبپذیری عمومی و خصوصی برای صفت عملکرد در ده ایزوله خالص هموکاریون قارچ خوراکی تکمه
در بین قارچهای خوراکی، قارچ خوراکی تکمهای سفید رایجترین قارچی است که در سراسر جهان کشت میشود. کشت این قارچ نخستین بار در قرن هفدهم میلادی در فرانسه شروع شد ولی تاکنون نسبت به گیاهان زراعی تلاشهای کمتری در مورد اصلاح آن صورت گرفته است. در حال حاضر حدود 38% کل تولید قارچهای خوراکی دنیا، به قارچ خوراکی تکمهای سفید اختصاص داده شده است.
علیرغم اهمیت اقتصادی زیاد و تولید وسیع جهانی قارچ خوراکی تکمهای سفید، برنامههای اصلاحی این قارچ به علل زیر با مشکلات زیادی روبرو بوده است. نخست این که بیشتر بازیدیوسپورهای این قارچ حاوی دو هستة هاپلوئید متفاوت و سازگار از نظر جنسی میباشد که پس از تندش تشکیل یک میسلیوم هتروکاریوتیکی بارور میدهد و تنها درصد اندکی از بازیدیوسپورها تک هستهای (یا با دو هسته مشابه) بوده و قابلیت انجام دو رگگیری را دارند. دوم این که اختلاف فنوتیپی قابل مشاهدهای بین میسلیومهای هموکاریون و هتروکاریون وجود ندارد و در نهایت آن که تندش اسپور به عنوان اولین گام در یک برنامة اصلاحی بسیار ضعیف و ناهماهنگ است و غالباً با آلودگیهای باکتریایی همراه میباشد. با وجود مشکلات فوق و پیشرفتهایی که در اصلاح این قارچ صورت گرفته است. روشهای بهبود نژادی در این قارچ عبارتند از: وارد کردن نژادهای مرغوب، جمعآوری ژرم پلاسمهای وحشی، گزینش درون نژادی، دورگگیری و مهندسی ژنتیک. در حال حاضر مهمترین برنامه اصلاحی این قارچ براساس دو رگگیری هدفمند در بین هموکاریونها میباشد. در روش دو رگگیری، هدف آن است که به یک نژاد با شاخصهای ژنتیکی مطلوب والدین و در نهایت بهبود صفات کمی و کیفی دست یافت. در این تحقیق ده جدایه هموکاریون مختلف که مورد تأیید قرار گرفته است، با انجام تلاقی دایآلل در بین آنها، سعی در گردآوری ژنهای مطلوب نژادهای مزبور در یک نژاد جدید دو رگ و بهبود ژنتیکی برای صفت عملکرد نمودهایم. نتایج مربوط به دورگگیری نشان میدهد، وقوع پدیدههایی همچون اثر متقابل میسلیومی در محل انجام تلاقی، تغییر سرعت رشد و ریخت پرگنه دو رگ نسبت به جفت هموکاریونها، میتواند به عنوان معیارهایی جهت انتخاب هیف از محل تلاقی در نظر گرفته شود. در زمان رشد دو رگها در محیط کشت PDA، قطر پرگنه، تیپ رشدی پرگنه یادداشت برداری شد. دورگهای حاصله جهت تأیید، به آزمون میوهدهی برده شد که با استفاده از طرح بلوک کامل تصادفی با دو تکرار مورد آزمون عملکرد قرار گرفتند. در طی این مرحله خصوصیاتی نظیر زمان پر کردن اسپاون، میزان عملکرد، وزن تک میوه اندازهگیری شد. سپس با انجام تجزیه دایآلل، قابلیت ترکیبپذیری عمومی و خصوصی اندازهگیری گردید و بهترین جدایه هموکاریون (A15-8) و بهترین دو رگ (130-7 A 15-6 ) مشخص شد. همچنین با بدست آوردن نسبت واریانس ترکیبپذیری عمومی به خصوصی، اهمیت هر یک از اثرات افزایشی و غالبیت در کنترل صفت عملکرد تعیین شد. بطوریکه این نسبت، معنیدار نبود که دلالت بر عمل غالبیت ژنها دارد یعنی صفت عملکرد توسط عمل غالبیت ژنها کنترل شده است.
مقدمه
امروزه تأمین غذا و بویژه پروتئین در کشورهای در حال توسعه به یکی از مسائل بنیادی تبدیل شده است. پروتئین مورد نیاز انسان از دو منبع اساسی شامل منابع حیوانی و دیگری منابع گیاهی قابل تأمین است. پروتئین گیاهی شامل حبوبات، غلات و میوهجات و سبزیجات است و پروتئین حیوانی عمدتاً شامل گوشت دامها، طیور، آبزیان و فراوردههای لبنی و دامی میباشد.
تاریخچه پرورش قارچ خوراکی تکمهای سفید:
کشت قارچ تکمهای سفید، در قرن هفدهم میلادی در حومه پاریس بوسیله باغبانان فرانسوی در هوای آزاد، صورت گرفت، با کشف این نکته، که وجود نور برای رشد این قارچ، ضروری نیست و در تاریکی هم میتوانند رشد نمایند. در اوایل قرن نوزدهم کشت و پرورش قارچ، در غارهای طبیعی، معادن و تونلهای حفر شده در فرانسه، توسعه زیادی پیدا کرد. کشت و پرورش قارچ، در اوایل نیمه دوم قرن 19 از اروپا به ایالات متحده امریکا سرایت کرد و در سال 1890، مزرعهداران ایالت پنسیلوانیای امریکا، به پرورش قارچ در فضاهای سرپوشیده اشتغال ورزیدند.
فهرست
دلایل عمده عملکرد پایین قارچ خوراکی تکمهای سفید در ایران 8
تاریخچه پرورش قارچ خوراکی تکمهای سفید -------- 10
آشنایی اجمالی با قارچ خوراکی تکمهای سفید ----- 12
طبقهبندی -------------------------------------- 12
رده بندی -------------------------------------- 12
اندام شناسی قارچ خوراکی تکمهای سفید ---------- 13
مشخصات پرگنه در کشت خالص ---------------------- 15
نامگذاری علمی قارچ خوراکی تکمهای سفید:-------- 15
تقسیم بندی واحدهای سلولی میسلیوم از لحاظ تعداد و ترکیببندی هستهای ---------------------------------------- 16
چرخ زندگی قارچ خوراکی تکمهای سفید ------------ 16
الف ـ هموتالیسم -------------------------- 19
ب ـ هتروتالیسم --------------------------- 20
روشهای بهبود نژادی در قارچ خوراکی تکمهای سفید: 24
کشت بافت -------------------------------------- 25
الف ـ کشت و گزینش تک اسپوری -------------- 26
ب ـ کشت و گزینش چند اسپوری --------------- 27
اختلاط ساده------------------------------------- 28
تلاقی هدفمند هموکاریونها------------------------ 28
1ـ روش سنتی تأیید هموکاریونها-------------- 29
2ـ تهیه و تایید هموکاریونهای والدی به روش تهیه پروتوپلاست ------------------------------------------- 30
3ـ تایید هموکاریونها با استفاده از نشانگر RFLP 30
4ـ تایید هموکاریونها با استفاده از نشانگر RAPD 31
الف ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تایید هیبریدها: 33
ب ـ استفاده از آیزوزایمها برای تایید هیبریدها: 34
ج ـ استفاده از نشانگرهای مقاومت برای تأیید هیبریدها 34
اصلاح برخی صفات با استفاده از روش تلاقی هیبریدها: 34
1ـ کشت اسپور------------------------------- 35
2ـ جداسازی تک اسپورها -------------------- 36
3ـ تهیه اسپاون ---------------------------- 36
ب ـ مراحل پرورش و میوهدهی: --------------- 37
تولید پریموردیا در سطح محیط کشت: ------------- 38
تولید اجسام میوه دهی در اسپاون----------------- 38
ج ـ تولید اندام باردهی در کمپوست---------- 39
1ـ انتقال ژن ------------------------------ 39
2ـ اختلاط پروتوپلاستها----------------------- 40
تهیه نژادها ----------------------------------- 42
روش تهیه محیط کشت غذایی PDA-------------------- 42
روش کشت هموکاریونها --------------------------- 43
روش تلاقی هموکاریونها--------------------------- 44
نمونهگیری از منطقه تلاقی ----------------------- 45
تهیه اسپاون مادری از هیبریدها------------------ 45
تلقیح دانههای گندم با کشت هیبرید--------------- 46
الف ـ پاستوریزاسیون و آمونیاکزدایی ------- 49
ب ـ مایهزنی کمپوست ----------------------- 49
ج ـ خاکدهی بستر کشت----------------------- 49
هوادهی و افت سریع دما-------------------------- 50
محاسبه قابلیت ترکیبپذیری عمومی و خصوصی ------- 53
محاسبه واریانس ترکیب پذیریی عمومی و خصوصی----- 53
محاسبه واریانس افزایشی و غالبیت--------------- 53
نتایج بررسی سرعت رشد (قطر پرگنه هموکاریونها)-- 55
تیپ رشدی پرگنه هموکاریون ---------------------- 55
نتایج سرعت رشد در هتروکاریونها ---------------- 59
نتایج مشاهدهای تهیه اسپاون -------------------- 60
نتایج مشاهدای آزمون میوهدهی ------------------- 60
جدول تجزیه واریانس برای صفت عملکرد در دورگها - 61
جدول قابلیت ترکیبپذیری عمومی در هموکاریونها -- 64
جدول قابلیت ترکیبپذیری خصوصی دورگها ---------- 64
جدول مقادیر اجزاء ژنتیکی ---------------------- 66
ضریب همبستگی ---------------------------------- 66
منابع ----------------------------------------- 69
پیوست------------------------------------------ 75
چکیده انگلیسی --------------------------------- 78
تحقیق انعقاد و ژله ای شدن ایزوله های پروتئین عصاره گیری شده از ماهیچه سبک tilapia بوسیله پردازش تغییر pH
چکیده:
انعقاد ایزوله های پروتئین عصاره گیری شده از ماهیچه Tilapia با استفاده از پردازش اسید و قلیا مقایسه شد با ماهیچه Tilapia شسته شده. ژلها آماده شدند همراه و بدون اضافه کرده 2% نمک در شرایط pH طبیعی و خصوصیات انعقاد و کیفیت ژل تعیین شد با استفاده از روش های متنوع. سختی و کشش ژل اندازه گیری شد با آزمون پیچش که با استفاده از نمک 2% در مقایسه با تیمار بدون رنگ بهبود یافت. آزمون استرس کوچک نشان داد که ضریب دخیره سازی ( G) خمیرهای ژل تا انعقاد حرارتی بود بالاتر در غیاب نمک در حالیکه اختلافات کوچکتر دیده شد بعد از انعقاد حرارتی. آزمون های استرس کوچک نشان داد یک مکانیسم فرم دهی ژل متفاوت برای پروتئین های تیمار شده اسیدی و قلیایی در مقایسه با ماهیچه های شسته شده. آزمون های پیچش نشان داد که پروتئنی های تیمار شده اسیدی و ماهیچه های شسته شده دارای کیفیت کمتری در مقایسه با پروتئین های تیمار شده قلیایی دارند. اضافه کردن نمک در ژلها اصلاح کرد ظرفیت نگهداری آب ژل را برای پروتئین های تیمار شده اسیدی و قلیایی. رویهم رفته پروتئین های تیمار شده اسیدی نشان دادند توانایی ضعیف تری در انعقاد در مقایسه با پروتئین های تیمار شده قلیایی. محتویات گروه های SH اندازه گیری شد قبل و بعد از انعقاد و باندهای S-S اختلافی در توانایی ساختار ژل در تیمارهای مختلف. نتایج نشان داد که پردازش اسیدی و قلیایی می تواند استفاده شود برای تولید ژل های پروتئینی کیفیت بالا از ماهیچه های مناسب tilapia برای تاسیس تولیدات غذایی دریایی.
مقدمه:
کیفیت و پایداری یک تولید کلی تحت تاثیر خصوصیات کاربردی پروتئین می باشد(Xiong, 2000). پروتئین ماهیچه ای دناتوره شده و تغییر شکل داده شده اثرات منفی بر روی خصوصیات کاربردی آنها دارد. بنابراین پروتئین ماهیچه ای که مورد بحث است برای pH بالا و پایین شبیه پردازش قلیا و اسیدی از نظر کاربردی اصلاح شده است.
Kristinsson و Hultin در سال 2003 نشان داده است که ساختار واحدی پروتئین ها قادر به تیمار pH که مسوول است برای اصلاح خصوصیات کاربردی ملاحظه انعقاد شدن، عصاره گیری و قابلیت حل شدن می باشد. ساختار چین خورده و غیر چین خورده پروتئین ها قابل انعطاف تر است و بنابراین فرض می شود که قادر باشد تا فرم دهی بهتر پروتئین در حرارت دهی صورت پذیرد. ژل های پروتئین ساخته شده از پروتئین های جدا شده با پردازش قلیایی و اسیدی از چندین گونه که نشان داده شده است گاهی اوقات برای خصوصیات انعقاد بهتر از تولیدات استفاده شده در تکنیک های پردازش متعارف و متداول است ( Choi & Park 2002; Hultin & Kelleher 2000, Kristinsson & demir 2003; Undeland, Kelleher & Hultin, 2002). نتایج نشان می دهد که تیمار اسیدی دارد یک اثر متفاوت روی ساختار پروتئین های ماهیچه ای در مقایسه با تیمار قلیایی همچنین در یک الگوی گونه ای ( Davenport & Kristinsson,2003; Kristinsson & Hultin 2003). طرز عمل قلیا برای تعدادی از نمونه های آب سرد بخوبی دمای نمونه های آب گرم نتایج عالی داشته است. این مطلب مهم است برای درک اینکه چه تغییرات مخصوصی اتفاق می افتد با ساختار پروتئین در خلال پردازش برای مطلوب سازی پروتئین ها. مطالعات قبلی روی استفاده از Tilapia بعنوان یک منبع surimi نشان داده شده است (Park et al 1999).
Klesk و همکارانش در سال 2000 مقایسه کردند کیفیت ژل Tilapia را با Alaska Pollock و ماهی نرم آرام ( اقیانوس آرام) و متوجه شدند که آن در مقایسه با Alaska Pollock بهتر بود زمانی که در درمای 90 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه حرارت دهی شد.
ژل ها ترکیب شدند و خصوصیاتشان و مکانیسم شکل آنها مطالعه شده است. خصوصیات ژل های پروتئین تعیین شد با نوع و تعداد برهمکنش پروتئین- پروتئین، تراکم و آرایش پروتئین غیر تا شده که تحت تاثیر pH هستند، شدت یونی، غلظت پروتئین و سرعت حرارت دهی و سرما دهی ( Xiong & Blacnchard, 1999). وجود دارد چندین راه موجود برای مطالعه خصوصیات یک ژل و مکانیسم شکل آنها، استفاده از دو مطالعه اصلی بنام آزمون استرس کوچک و استرس بزرگ. ترکیب این سنجش ها می تواند اطلاعات ارزشمندی را در خصوص ژل و کیفیت آن به ما ارزانی دارد. آزمون استرس کوچک یک نمونه ای از تغییر شکل یافتن بدون از بین رفتن ساختار آن می باشد. حرارت و سرما دادن یک ژل با استفاده از فرکانس پایین و ازمایشات نوسانی استرس کوچک یکی از بهترین روشهای درخواستی برای تغییرات در خصوصیات فیزیکی مرتبط با خصوصیات مولکولی یک ژل می باشد ( Hamman 1991, Hamman & Mac Donald 1992). آزمون استرس بزرگ زمانی است که یک نمونه تغییر شکل یافته است و ساختار ان دچار تغییر شده و در واقع شکسته شده است. آزمون استرس بزرگ مثل انقباض خصوصیات اساسی و بنیادی یک ژل را برآورد می کند و به ما نشان می دهد که با حس در ارتباط است. آزمون انقباض و پیچش یک روش مرسوم برای آزمون سختی ( استرس برشی) و کشش ( استرس کششی) ژلهای surimi می باشد. مشاهدات کلی این مطالعه در مورد ارزشیابی کیفیت ژل های آماده شده و استفاده شده برای پروتئین های ماهیجه ای جدا شده از ماهیچه سفید Tilapia با استفاده از پردازش قلیایی و اسیدی است که مقایسه می شود با ژل های آماده شده برای استفاده ماهیچه Tilapiaی شسته شده که شبیه است به Surimi بدون استفاده از مواد محافظ می باشد.
2- مواد و روش ها:
2-1: مواد خام: ماهیچه های Tilapia (200-170 گرم) بدست آمد از یک منطقه محلی ( Rain Forest Aquaculture, Fl) ماهیچه ها پردازش می شوند فورا بعد از اینکه ماهی ها کشته شدند و منتقل شدند به جعبه های استیروفوم روی یخ درون آزمایشگاه و ذخیره سازی می شوند در یک اتاق سرد در دمای 4 درجه سانتی گراد تا پردازش شوند ( در 24 ساعت از زمان برش خوردن). ماهیچه قرمز بصورت دستی برش خورده و از ماهیچه سفید جدا و دور انداخته شدند. ماهیچه های سفید باقی مانده با یک دستگاه خرد کن خورد شدند ( Scorille Hamilton Beach, Washington, NC) با سوراخ های 6 میلی متری. همه پروپاراسیون ها ( نمونه های آماده شده) در یک اتاق سرد در دمای 4 درجه سانتی گراد یا روی یخ مهیا شد و استفاده شد برای نگهداری در دمای زیر 5 درجه سانتی گراد.
2-2: تدارک ماهیچه شسته شده:
ماهیچه خورد شده با آب مقطر سرد مخلوط گردید به نسبت حجمی 1:3 و اجازه داده شد تا ته نشین شود برای 15 دقیقه و هر 5 دقیقه تکان داده شد با یک قاشق پلاستیکی. این مخلوط ریخته شد بدرون یک صافی با دولایه پارچه ململ و اب بصورت دستی با فشار از آن خارج شد. این موارد دوباره تکرار گردید و در آخرین بار شستشو آب حاوی 2/0 % نمک جهت آبگیری پروتئین های ماهیچه سفید Tilapia بکار گرفته شد.
2-3: آماده سازی ایزوله های پروتئین: ماهیچه های خورد شده با اب مقطر سرد به نسبت حجمی 1:9 مخلوط و سپس به مدت 60 ثانیه هم زده شدند ( دوبار به مدت 30 ثانیه). با استفاده از یک خرد کن ( مخلوط کن) waring ( (Waring Products Dirision, New Hartford, CT در خروجی برقی 40% و بدقت ریخته شد درون یک بشر پلاستیکی روی یخ.
مواد همگن شدند و از نظر pH تنظیم شدند در 2.5,2.9,11,11.2 تا پروتئین ها حل شوند با استفاده از HCl 2 مولار و یا Na OH 2 مولار. مواد یکنواخت شده ریخته شدند بدرون یک سانتریفوژ و سانتریفوژ شدند با دور 10000g به مدت 2 دقیقه در یک Sorvall RC-5B Using a GS-3 Rotor . نتایج سانتریفوژ این بود که سه لایه تشکیل گردید. سوپ بالایی جدا شده و رسوب داده شد توسط ریختن محتویات تیوب های سانتریفوژ بدرون یک صافی حاوی دو لایه پارچه ململ. سوپرناتنت انتخاب شده در معرض رسوب دهی ایزوالکتریک قرار گرفت و با تنظیم pH روی 5/5 و دوباره سانتریفوژ شد در دور10000g برای 20 دقیقه. رسوب در یک کیسه زیپ دار قرار گرفت و روی یخ نگهداری شد در یک اتاق سرد در دمای 4 درجه سانتی گراد بصورت شبانه.
2-4: محتویات رطوبتی:
برای تعیین رطوبت ایزوله های پروتئین و ماهیچه های شسته شده تقریبا 5 گرم نمونه در یک دستگاه توازن رطوبتی ( CSC Scientific Company. Inc, Fair fax,VA)قرار گرفت. تهیه نمونه اولیه برای اندازه گیری های تغییر شکل ماده شامل ایزوله پروتئین وپروتئین شسته شده تنظیم شد با 90% رطوبت بوسیله اضافه کردن آب مقطر بر اساس فرمول زیر:
برای کیفیت آنالیز ژل ایزوله های پروتیئن تا 83% رطوبت تنظیم شد با استفاده از خروج آب بصورت دستی.
ماهیچه های شسته شده نیاز به سانتریفوژ داشت که این کار انجام شد در دور 10000g به مدت 20 دقیقه در یک دستگاه سانتریفوژ RC-5B با استفاده از روتور ( GS-3) برای رسیدن به رطوبت مطلوب.
2-5: تغیر شکل ماده: نمونه ها برای تغییر شکل ماده آماده شد توسط قرار دادن 25 تا 30 گرم ایزوله پروتئین/ ماهیچه شسته شده ( 20% رطوبت) در یک بشر پلاستیکی 100 میلی لیتری. ماهیچه شسته شده/ ایزوله همگن شدند با یک نگهدارنده دستی Tissue Tearor ( Biospec Products, Inc., Bartlesvill. CK) برای یک دقیقه با سرعت 6، سپس 25 میلی مولار از سدیم فسفات دوظرفیتی اضافه شد و دوباره همگن شد برای 2 دقیقه روی همان سرعت جهت مخلوط شدن. در نهایت نمک 2% اضافه شد و مخلوط شد با یک قاشق استیل.
pH خمیر تنظیم شد روی 1/7-2/7 با NaOH 2 مولار و پیرو آن با یک قاشق استیل مخلوط شد.
بعد از تنظیم pH با یک پارافیلم درب آن بسته شد و روی یخ قرار گرفت به مدت 30 دقیقه قبل از اندازه گیریها.
نمونه ها از نظر زمانی شامل 30 دقیقه بود که تا 60-50 دقیقه در نظر گرفته شد. تغییرات ویسکوالاستیک روی حرارت و سرمادهی با استفاده از AR2000 Adwanced Rheometer تعیین شد (TA Instrument, New Castle, DE).